পদ্ধতি
1. নমুনা প্রস্তুতি
ক্লিনিকাল নমুনা থেকে ডিএনএ নিষ্কাশন ভাইরাস ডিএনএ নিষ্কাশন কিটের সংশ্লিষ্ট প্রয়োজনীয়তা এবং পদ্ধতি অনুযায়ী পরিচালিত হয়।নিষ্কাশিত
ডিএনএ সনাক্তকরণের জন্য সরাসরি ব্যবহার করা যেতে পারে।যদি নিষ্কাশনের পরপরই নমুনাটি সনাক্ত না করা হয়, তবে এটিকে স্ট্যান্ডবাইয়ের জন্য -70 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা উচিত, বারবার জমাট-গলে যাওয়া চক্র এড়ানো।
2. প্রতিক্রিয়া সিস্টেম প্রস্তুতি
(1) সিস্টেম প্রস্তুতি: কিট থেকে বিকারকটি বের করে নিন এবং ঘরের তাপমাত্রায় এটি সম্পূর্ণভাবে গলাতে দিন।অবিলম্বে মিশ্রণ এবং সেন্ট্রিফিউজ উল্টে দিন।N পরীক্ষার প্রতিক্রিয়া (N = পরীক্ষিত নমুনার সংখ্যা + ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ + নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ + 1) প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের জন্য প্রস্তুত করা হয়, যথাক্রমে, নিম্নরূপ।
| উপাদান |
1 প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের জন্য ভলিউম |
N বিক্রিয়া সিস্টেমের জন্য আয়তন |
| পিসিআর প্রতিক্রিয়া বাফার |
14μL |
14μLx N |
| পিসিআর এনজাইম মিশ্রণ |
1μL |
1μLx N |
| মোট আয়তন |
15μL |
15μLx N |
(2) প্রতিক্রিয়া সিস্টেম বিতরণ: উপরের প্রতিক্রিয়া বাফার, সেন্ট্রিফিউজ ভালভাবে মিশ্রিত করুন এবং ফ্লুরোসেন্ট পিসিআর যন্ত্রের জন্য উপযুক্ত পিসিআর টিউবে 15μL অ্যালিকোট বিতরণ করুন।(30 সেকেন্ডের জন্য PCR টিউবগুলিকে 6,000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং নমুনা চিকিত্সা অঞ্চলে পরিবহন করুন।)
3. নমুনা লোডিং (নমুনা চিকিত্সা অঞ্চল)
উপরের পিসিআর টিউবগুলিতে যথাক্রমে 10μL নিউক্লিক অ্যাসিড নমুনা, নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ এবং ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ যোগ করুন।টিউবগুলিকে শক্তভাবে ঢেকে রাখুন এবং 10 সেকেন্ডের জন্য 6,000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং তারপরে PCR পরিবর্ধন অঞ্চলে পরিবহন করুন।
* সতর্কতা: নিম্নলিখিত ক্রমে নমুনা যোগ করা হয়
প্রস্তাবিত: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ-> নিউক্লিক অ্যাসিড নমুনা -> ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ।
4. PCR পরিবর্ধন (PCR পরিবর্ধন অঞ্চল)
4.1 পরিবর্ধনের জন্য রিয়েল-টাইম পিসিআর মেশিনে ক্যাপড পিসিআর টিউবগুলি রাখুন৷
4.2 ফ্লুরোসেন্স পিসিআর সাইকেল কন্ডিশন সেটিং
| কার্যক্রম |
তাপমাত্রা |
প্রতিক্রিয়া সময়কাল |
চক্রের সংখ্যা |
|
1
|
50°C |
২ মিনিট |
1 |
| 2 |
95°C |
2 সে |
1 |
| 3 |
95°C |
1 সে |
41 |
| 60°সে |
13s/20s/35s |
ধাপ 3:60℃ এ ফ্লুরোসেন্ট সংকেত সংগ্রহ করুন;ABI 7500 এর জন্য 35s, SLAN-96S/96P এর জন্য 20s, অন্য রিয়েল-টাইম PCR সিস্টেমের জন্য 13s।মোট আয়তন: 25μL।
4.3 সনাক্তকরণের পরে নিষ্পত্তি
প্রতিক্রিয়ার পরে পিসিআর টিউবগুলি একটি সিল করা ব্যাগে ফেলে দিন এবং ব্যবহৃত টিউবগুলিকে চিকিৎসা বর্জ্য হিসাবে বিবেচনা করুন।
5. ফলাফল বিশ্লেষণের জন্য সেটিংস
সূচকীয় পরিবর্ধনের আগে একটি অঞ্চলে বেসলাইন সেট করুন যেখানে সমস্ত নমুনার ফ্লুরোসেন্ট সংকেত তুলনামূলকভাবে স্থিতিশীল (সমস্ত নমুনায় কোনও উল্লেখযোগ্য ওঠানামা নেই);শুরুতে সংকেত ওঠানামা থেকে সূচনা বিন্দু (সাইকেল নম্বর) সেট করুন
ফ্লুরোসেন্স সংগ্রহের পর্যায়;সূচকীয় পরিবর্ধনে প্রবেশের জন্য প্রথম নমুনার Ct-এর আগে শেষ বিন্দু (সাইকেল নম্বর) 1~3 সাইকেল সেট করুন।4 ~ 15 চক্র সুপারিশ করা হয়.
নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ পরিবর্ধন বক্ররেখা (অনিয়মিত শব্দ বক্ররেখা) এর সর্বোচ্চ বিন্দুর উপরে প্রান্তিকটি ঠিক করুন।
6. মান নিয়ন্ত্রণের মানদণ্ড
নমুনা ফলাফল মূল্যায়ন করার আগে, ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ এবং নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ নীচের ব্যাখ্যা সারণী ব্যবহার করে ব্যাখ্যা করা উচিত, এবং ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ এবং নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ বক্ররেখা অবশ্যই সঠিকভাবে সম্পাদন করতে হবে, অন্যথায় নমুনা ফলাফলটি অবৈধ।
চ্যানেল/
নিয়ন্ত্রণ করে |
সাইকেল থ্রেশহোল্ড(Ct) মান |
| FAM |
ভিআইসি |
| ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ |
Ct > 40 বা UNDET |
Ct > 40 বা UNDET |
| নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ |
Ct ≤ 35 |
Ct ≤ 35 |
7. পরীক্ষার ফলাফলের ব্যাখ্যা
মাঙ্কিপক্স ভাইরাসের জন্য FAM চ্যানেল, সনাক্তকরণের ফলাফল নীচের মত ব্যাখ্যা করা উচিত।
a) ধনাত্মক: Ct ≤ 38 এবং পরিবর্ধন বক্ররেখা S-আকৃতির।
b) সন্দেহজনক: 38 < Ct ≤ 40 এবং পরিবর্ধন বক্ররেখা S-আকৃতির, একটি দ্বিতীয় পরীক্ষা প্রয়োজন।দ্বিতীয় পরীক্ষার জন্য Ct ≤ 40 এবং পরিবর্ধন বক্ররেখা S-আকৃতির হলে ইতিবাচক বিবেচনা করুন।দ্বিতীয় পরীক্ষার জন্য VIC চ্যানেলে Ct > 40 বা নাল Ct এবং Ct ≤ 35 হলে নেতিবাচক হিসাবে বিবেচিত হয়।
গ) নেতিবাচক: VIC চ্যানেলে Ct > 40 বা নাল Ct এবং Ct ≤ 35।
ঘ) পুনরায় পরীক্ষা করুন: ভিআইসি চ্যানেলে Ct > 40 বা নাল Ct এবং Ct > 35।
আপনার বার্তাটি 20-3,000 টির মধ্যে হতে হবে!
